Evaluación de la actividad recombinasa e integrase sitio-específica de relaxasas conjugativas en bacterias y en células humanas

Abstract

ABSTRACT: With this work we have got insight into the molecular characterization of site-specific recombination and integration reactions mediated by relaxases. We have carried out an extensive mutagenesis of trwC that suggest that the improvement of relaxase TrwC as recombinase by altering one or two residues is not possible. Moreover, we have analysed the DNA requirements of the integration reaction by TrwC. Apart from TrwC, we have found that TraI proteins from plasmids F and pKM101 also have oriT-specific recombinase activity. In contrast, we did not detect F_TraI-mediated integration, suggesting a difference with TrwC. The potential use of TrwC for genomic engineering has been studied in human cells. We found that TrwC is active in human cells and it can act as a site-specific integrase, although not efficiently. The rate of integration of TrwC-driven DNA suggests that TrwC may be stabilizing the DNA in the human cell, favouring its random integration.

RESUMEN: Con este trabajo hemos profundizado en la caracterización molecular de las reacciones de recombinación e integración sitio-específica mediadas por relaxasas. Hemos llevado a cabo una extensa mutagénesis de trwC que sugiere que su actividad recombinasa no se puede mejorar alterando uno o dos residuos. Además, hemos analizado los requerimientos de ADN de la reacción de integración mediada por TrwC. Aparte, hemos encontrado que las relaxasas de los plásmidos F y pKM101 también tienen actividad recombinasa oriT-específica. En cambio, no hemos detectado integración mediada por F_TraI, lo que sugiere diferencias con TrwC. Hemos estudiado el potencial uso de TrwC para ingeniería genética en células humanas. Encontramos que TrwC es activa en células humanas y que puede catalizar la integración sitio-específica, aunque no eficientemente. La tasa de integración de TrwC sugiere que la relaxasa podría estar estabilizando el ADN, favoreciendo su integración al azar.