Construcción de una genoteca en

Abstract

La técnica de phage display es una poderosa herramienta que permite la expresión de proteínas heterologas en la cápside de un bacteriófago. Esta herramienta es de utilidad para el análisis funcional de dichas proteínas al permitir aislar tanto la proteína como la secuencia de DNA que codifica para ella en la misma particula vìrica. La tecnología de phage display ha sido utilizada para el estudio de genotecas de péptidos y anticuerpos que presentan afinidad por un ligando de interés. A partir de una genoteca que contiene diversas proteínas se seleccionen polipeptidos en función de su afinidad por un ligando especifico, pudiendo ser este ligando desde una moléculasimple, hasta un complejo multimolecular, una celula o incluso un tejido. Además el phage display tiene una gran versatilidad en el momento de la selección, que se puede llevar a cabo en procesos in vitro o in.vivo. El objetivo de este trabajo ha sido utilizar el principio de phage display para construir una genoteca en la cual estuviera representada una gran cantidad de proteínas de D. melanogaster, principalmente que pudieran estar involucradas en la regulación o desarrollo de la respuesta inmune innata. Esta genoteca se empleara en trabajos posteriores para la selección mediante biopanning de receptores para patógenos concreto y de proteínas capaces de interaccionar con otros componentes del sistema inmunitario de D. melanogaster. La genoteca se ha llevado a cabo a partir de RNA mensajero obtenido de moscas sometidas a distintos tipos de reto inmunológico, en función de las diversas vías de que activan la respuesta inmunes inata en D. melanogaster (via Toll para Gram+ y hongos, via Imd para Gram-). Para permitir la expresión en phage display se ha empleado el vector T7Select 10-3b, en el cual se ligan los insertos de cDNA en el extremo 3´de la proteína 10-3b de la cápside. Para estudiar la representatividad de la genoteca, se ha caracterizado el tamaño y numero de insertos de cDNA contenidos en una muestra de 72 clones seleccionados al azar. Un grupo de ellos fueron subclonados para facilitar su secuenciación, y poder determinar si las proteínas heterologas expresadas en la cápside del bacteriófago T7 se encontraban fusionadas en fase con la proteína 10-3b.