Nuevas membranas de fibra hueca para purificación de exosomas

Abstract

Las vesículas extracelulares (sEVs) han despertado un gran interés en los últimos años debido a sus prometedoras propiedades en el transporte intercelular de biomoléculas, que evidencia su potencial en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. A pesar de ello, debido a la complejidad de los medios biológicos en los que se encuentran, como el plasma, orina o los medios de cultivo celular, su separación y purificación sigue siendo un desafío para su aislamiento y purificación eficiente, reproducible y escalable. Si bien se han explorado numerosos métodos de separación para estas partículas, los métodos de referencia tradicionales, como la ultracentrifugación, presentan limitaciones en cuanto a tiempos de operación elevados, dificultad de escalabilidad o por ser técnicas agresivas mecánicamente con las sEVs. En este contexto, la separación por flujo tangencial con membranas de fibra hueca se presenta como una alternativa prometedora frente a técnicas tradicionales, al permitir una separación basada en el tamaño de las partículas, escalable, con elevada selectividad y capacidad para preservar la funcionalidad de las sEVs debido a un menor impacto mecánico sobre estas. El objetivo de este trabajo es contribuir al desarrollo de la tecnología de membranas para esta aplicación mediante el estudio funcional y caracterización de distintas membranas de fibra hueca para su aplicación en procesos de purificación y separación de sEVs. Un criterio fundamental para esta aplicación es el cut-off de la membrana o tamaño de poro que determina qué partículas no pueden pasar a través de ella con rechazos de 90-95%. En el caso de los exosomas, con tamaño medio entre 30 y 120 nm, se requieren membranas con cut-off adecuado, alrededor de 0,1 μm, de forma que sean capaces de permitir el paso de los sEVs y retener otros componentes en el medio de cultivo, como otras vesículas de mayor tamaño o agregados proteicos con menor interés o potencial de aplicación clínica. Para este fin, se han seleccionado membranas poliméricas desarrolladas por el grupo de investigación a partir de polímeros biocompatibles como el poliacrilonitrilo (PAN) y el fluoruro de polivinilideno (PVDF), así como membranas comerciales de polipropileno (PP) con propiedades morfológicas conocidas. Se emplea porometría de flujo capilar para determinar el tamaño medio de los poros, se evalúan las propiedades de transporte de las fibras, determinando su permeabilidad hidráulica y se simula el comportamiento en la separación de nanopartículas de poliestireno modelo de 500, 200, 100 y 50 nm, representativas del tamaño de las sEVs, mediante sucesivas filtraciones. Las fibras huecas de PVDF, con tamaño de poro de 0,22 ± 0,01 μm y baja permeabilidad (3,71 ± 0,63 L/m²·h·bar), se descartaron. Las fibras de PAN presentaron un tamaño de poro adecuado (0,11 ± 0,01 μm) y una permeabilidad competitiva (93,02 ± 8,39 L/m²·h·bar), pero su poca estabilidad mecánica a la manipulación y en operación impidió su aplicación práctica. En cambio, las fibras comerciales de PP (tamaño de poro de 0,1 μm y permeabilidad de 144,85 ± 4,64 L/m²·h·bar) mostraron un buen desempeño, con rechazos del 78 %, 66 %, 50 % y 40 % para nanopartículas de 500, 200, 100 y 50 nm, respectivamente. En conclusión, estas membranas se presentan como una opción viable para la separación de sEVs, si bien queda por determinar en trabajos futuros la razón del alto rechazo observado para las nanopartículas de 50 nm y el desempeño con muestras reales.

Extracellular vesicles (EVs) have attracted great interest in recent years due to their promising properties in the intercellular transport of biomolecules, highlighting their potential in therapeutic and diagnostic applications. However, because of the complexity of the biological media in which they are found—such as plasma, urine, or cell culture media—their separation and purification is a challenge in order to achieve efficient, reproducible, and scalable isolation. Although numerous separation methods for these particles exist, traditional reference techniques such as ultracentrifugation present limitations, including long processing times, difficulties in scalability or due to their mechanically aggressive condition toward sEVs. In this context, tangential flow separation using hollow fiber membranes emerges as a promising alternative to conventional techniques, enabling size-based separation that is scalable, highly selective, and capable of preserving sEV functionality thanks to its reduced mechanical impact. The aim of this work is to evaluate the feasibility of different hollow fiber membranes for application in sEV purification and separation processes. For this study, polymeric membranes developed by the research group from PAN and PVDF with a theoretical pore size close to 0,1 μm, as well as commercial PP membranes with well-known morphological properties, were selected. A key condition for this application is the membrane cut-off or limiting pore size, which determines which particles can pass through. In the case of exosomes, with an average size between 30 and 120 nm, membranes with an adequate cut-off around 0,1 μm are required, so that they allow sEVs flow through the permeate while retaining contaminants present in the culture medium, such as other microvesicles or protein aggregates. The experimental methodology is based on the morphological and functional characterization of the membranes. Capillary flow porometry was used to determine the mean pore size; transport properties of the fibers were evaluated by determining their hydraulic permeability; and the behavior in the separation of model nanoparticles, representative of the size range of sEVs, was simulated through successive filtrations with nanoparticles of 500, 200, 100, and 50 nm. These filtrations made it possible to assess size-based rejection and membrane selectivity under controlled conditions, thereby determining the suitability of each fiber type for exosome separation. Within this framework, the objective is to identify which membranes are suitable for sEVs separation and to assess the feasibility of designing a sequential filtration process for the efficient isolation of these particles. PVDF fibers present a pore size of 0,22 ± 0,01 μm and low permeability (3,71 ± 0,63 L/m²·h·bar), so they are unfeasible for this application, as they would result in excessively long operation times. PAN fibers exhibited favorable morphological and transport properties, pore size of 0,11 ± 0,01 μm and a permeability of 93,02 ± 8,39 L/m²·h·bar, however, their fragility hindered their practical application. In contrast, the commercial PP fibers, with a pore size of 0,1 μm and a permeability of 144,85 ± 4,64 L/m²·h·bar, showed good performance, achieving rejections of 78 %, 66 %, 50 %, and 40 % for nanoparticles of 500, 200, 100, and 50 nm, respectively. In conclusion, these membranes appear as a viable option for sEV separation, while PAN fibers represent a promising basis for future optimization