La identificación de anticuerpos antinucleares (ANA) es crucial para diagnosticar y
clasificar las enfermedades reumáticas asociadas a ANA (AARD), como la esclerosis
sistémica (SSc) y las miopatías inflamatorias idiopáticas (IIMs). Los ensayos
comerciales de fase sólida son ampliamente utilizados debido a su alta reproducibilidad
y rentabilidad, aunque pueden no detectar autoanticuerpos raros o recién descritos. En
este proyecto, se utilizó la técnica de inmunoprecipitación seguida de espectrometría de
masas (IP-MS) para identificar los antígenos de autoanticuerpos en pacientes con
clínica de AARD y seropositivos en inmunofluorescencia HEp2, cuyas pruebas estándar
no detectaron reactividad específica y/o proporcionaron resultados inconclusos.
La técnica IP consistió en unir los autoanticuerpos a perlas magnéticas, seguida del
aislamiento de autoantígenos a partir de extractos de proteínas nucleares de células
HeLa. Después de la digestión enzimática, los péptidos resultantes fueron analizados
por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), procesando los datos
mediante el software ProteinLynx Global Server para identificar proteínas. La
identificación se basó en la coincidencia de secuencias de péptidos con proteínas
conocidas, utilizando valores Hi-3 para estimar las cantidades relativas de proteínas.
Este enfoque permitió identificar tanto de autoantígenos conocidos como poco
comunes, destacando el potencial de la IP-MS para ampliar el diagnóstico de las AARD,
especialmente en casos negativos o ambiguos. La integración de herramientas
proteómicas podría mejorar la estratificación de enfermedades y el descubrimiento de
nuevos biomarcadores.
The identification of antinuclear antibodies (ANA) is crucial for diagnosing and classifying
ANA-associated rheumatic diseases (AARD), including systemic sclerosis (SSc) and
idiopathic inflammatory myopathies (IIMs). The commercial solid-phase assays are
widely used due to their high reproducibility and cost-effectiveness. However, they may
fail detecting rare or newly described autoantibodies. In this project, immunoprecipitation
followed by mass spectrometry (IP-MS) was applied to uncover autoantibody targets in
HEp2 indirect immunofluorescence test positive patients with AARD clinical
manifestations, for whom standard assays could not detect any specific autoantibody
reactivity and/or provided inconclusive results.
The IP technique involved binding patient autoantibodies to magnetic beads, followed by
autoantigen isolation from HeLa cell nuclear protein extracts. After enzymatic digestion,
the resulting peptides were analysed by liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS), with data processed by ProteinLynx Global Server software to identify proteins. The
identification was based on matching peptide sequences with known proteins, focusing
on Hi-3 values to estimate relative protein amounts.
This approach enabled the identification of well-characterized and uncommon
autoantigens, highlighting the potential of IP-MS to expand the diagnostic landscape for
AARDs, especially in negative cases or ambiguous standard assay results. Integrating
proteomic tools in autoimmunity studies may improve disease stratification and discovery
of novel biomarkers.
