Estudio bioquímico y estructural de complejos macromoleculares implicados en la diseminación de genes de resistencia a antibióticos

Abstract

La resistencia bacteriana a los antibióticos es un problema global que continúa creciendo de forma alarmante. Esta situación, en combinación con la dificultad para desarrollar y validar nuevos antibióticos, pone de manifiesto la necesidad imperiosa de buscar nuevas estrategias frente a esta emergencia sanitaria. El mecanismo más desarrollado y estudiado por el cual las bacterias adquieren la capacidad de transmitir los genes de resistencia a antibióticos es la transferencia horizontal de genes, principalmente mediante el proceso de conjugación bacteriana. En bacterias Gramnegativas este proceso es mediado por un Sistema de Secreción Tipo IV, el relaxosoma y el pilus. Este proyecto se ha centrado en el estudio de parte del complejo del relaxosoma, usando como modelo el plásmido conjugativo R388. El relaxosoma es responsable del procesamiento inicial del ADN plasmídico y está compuesto por la relaxasa TrwC y dos proteínas auxiliares (IHF y TrwA) unidas al origen de transferencia del plásmido. En este trabajo se ha llevado a cabo la clonación, sobreexpresión y purificación de la proteína IHF (Factor de Integración del Hospedador) para, en un futuro, tratar de formar el relaxosoma completo. La formación del complejo IHF-ADN tiene como objetivo demostrar, en futuros proyectos, que la curvatura inducida en el ADN tras la unión de IHF favorece el acoplamiento del resto de proteínas.

The emergence and spread of antibiotic-resistant bacteria represent a major and growing threat to global health. This challenge, combined with the difficulty in developing new antibiotics, highlights the urgent need to explore alternative strategies to face this health emergency. The most studied and well-characterized mechanism by which bacteria acquire and disseminate antibiotic resistance genes is horizontal gene transfer, primarily mediated through bacterial conjugation. In Gram-negative bacteria this process involves the Type IV Secretion System, the relaxosome and the pilus. In order to characterize this system, this project focuses on characterizing components of the relaxosome complex, using plasmid R388 as a model system. The relaxosome is responsible for the initial processing of plasmid DNA and it is composed of the TrwC relaxase and two auxiliary proteins (IHF and TrwA) bound to the origin of transfer of the plasmid. In this project, the Integration Host Factor (IHF) protein was cloned, overexpressed and purified. Subsequently, the IHF-DNA complex was assembled. This study provides the basis for future research, to demonstrate how the DNA U-turn induced by IHF binding facilitates the recruitment and assembly of other proteins that also constitute the relaxosome complex.