Caracterización bioquímica y estructural del anticoagulante trombostatina y expresión de la protrombina en células de insecto

Abstract

La trombosis está involucrada en una de cada cuatro muertes en todo el mundo y supone un coste significativo en términos de discapacidad. En España, más de un millón de personas están en tratamiento profiláctico con anticoagulantes. Dado el alto coste económico y humano debido a este tipo de trastornos y los riesgos e inconvenientes relacionados con las terapias farmacológicas actuales, es necesario proporcionar nuevos anticoagulantes que sean más seguros, efectivos y asequibles. En general, este proyecto abarca dos enfoques científicos. Primero, implica el estudio de inhibidores naturales de la trombina como potenciales anticoagulantes para su uso en la clínica. Específicamente, este trabajo tiene como objetivo caracterizar, tanto bioquímica como estructuralmente, el inhibidor llamado trombostatina para usar esta información en el diseño racional de proteínas híbridas con actividad anticoagulante mejorada. En este sentido, se ha determinado la actividad de diferentes fragmentos del mismo, mientras que también se detallan los esfuerzos para resolver la estructura cristalográfica de la trombina en complejo con este péptido natural. El segundo enfoque tiene como objetivo explorar el potencial de la protrombina como nueva diana farmacológica. Datos preliminares del laboratorio sugieren que una serie de péptidos macrocíclicos podrían afectar la flexibilidad de la enzima y, en consecuencia, la vía de procesamiento normal de este zimógeno durante su activación. Para confirmar el mecanismo de acción llevado a cabo por estas moléculas se requerirán muestras puras de protrombina. Aquí, presentamos los protocolos que se han desarrollado para permitir la expresión recombinante de diferentes variantes de la misma.

Thrombosis is involved in one out of every four deaths worldwide and results in a significant cost in terms of disability. In Spain, more than one million people are on prophylactic anticoagulant treatment. Given the high economic and human costs due to these kinds of disorders and the risks and inconveniences related to the current pharmacological therapies, it is necessary to develop new anticoagulants that are safer, more effective, and affordable. Overall, this project encompasses two scientific approaches. First, it involves studying natural thrombin inhibitors as potential anticoagulants to be used in the clinic. Specifically, this work aims to characterize, both biochemically and structurally, the inhibitor named thrombostasin in order to use this information for the rational design of hybrid proteins with improved anticoagulant activity. In this regard, the activity of different fragments of thrombostasin has been determined, while efforts to solve the crystallographic structure of thrombin complexed with this natural peptide are also detailed. The second approach aims to explore the potential of prothrombin as a new pharmacological target. Preliminary data from the laboratory suggest that a series of macrocyclic peptides could affect the flexibility of the enzyme and consequently the normal processing pathway of this zymogen during its activation. To confirm the mechanism of action exerted by these molecules, pure prothrombin samples will be required. Here, we report the protocols that have been developed to enable the recombinant expression of different prothrombin variants.