Advanced methodology for LPS capture from biofluids

Abstract

ABSTRACT: Lipopolysaccharide (LPS), or endotoxin, is the main component of the outer membrane of Gram-negative bacteria where lipid A is the responsible segment for its toxicity. It poses a serious risk when detected both in different industries and environments and when is present in human bloodstream as it can lead to sepsis, an exaggerated response to LPS that triggers immune suppression, organ dysfunction or even death. Unfortunately, alternative methods for contaminant removal through extracorporeal blood detoxification processes present drawbacks that make endotoxin detection/removal a crucial challenge to achieve safe and effective detoxification processes. In this regard, magnetofluidic devices deserve special attention and involve two main steps: the sequestration of LPS on suitably functionalized magnetic nanoparticles (MNPs) and, the removal of the MNPs-LPS complex from the biological fluid. Consequently, this dissertation provides an integrated methodology to advance the design of the LPS sequestration step to promote its separation from biofluids through the synthesis of an antilipopolysaccharide (LALF) protein from Limulus polyphemus species using genetic engineering techniques in addition to the quantification of the binding strength of the LALF protein to LPS through a newly approach and addressing the variables that affect the formation of the complex. In addition, in order to contribute to the development of an application for continuous LPS capture, as a first approach, homogeneous and heterogeneous L-L separation of aqueous anions (chromate) in microdevices is addressed experimentally and by means of a theoretical model developed with ANSYS FLUENT, laying the foundations to continue with the microfluidic design for L-S separation and finally, its application to LPS capture.

RESUMEN: El lipopolisacárido (LPS), o endotoxina, es el principal componente de la membrana externa de las bacterias Gram negativas donde el lípido A es el segmento responsable de su toxicidad. Su presencia supone un grave riesgo tanto en diferentes industrias y entornos como cuando llega al torrente sanguíneo pudiendo conducir a la sepsis, una respuesta exagerada al LPS que desencadena una supresión inmunitaria, una disfunción orgánica o incluso la muerte. Lamentablemente, los métodos alternativos para la eliminación de contaminantes a través de procesos de detoxificación extracorpórea de la sangre presentan inconvenientes que hacen que la detección/eliminación de endotoxinas sea un reto crucial para lograr procesos de detoxificación seguros y eficaces. En este sentido, los dispositivos magnetofluídicos merecen especial atención e implican dos etapas principales; el secuestro de LPS en nanopartículas magnéticas (MNPs) convenientemente funcionalizadas y, la eliminación del complejo MNPs-LPS del fluido biológico. En consecuencia, esta disertación aporta una metodología integrada para avanzar en el diseño de la etapa de secuestro de LPS para promover su separación de los biofluidos a través de la síntesis de una proteína antilipopolisacáridos (LALF) procedente de la especie Limulus polyphemus mediante técnicas de ingeniería genética además de la cuantificación de la fuerza de unión de la proteína LALF al LPS mediante un nuevo enfoque y teniendo en cuenta las variables que afectan a la formación del complejo. Además, con el objeto de contribuir al desarrollo de una aplicación para la captura de LPS en continuo, como primera aproximación, se aborda para la separación homogénea y heterogénea L-L de aniones acuosos (cromato) en microdispositivos experimentalmente y mediante un modelo teórico desarrollado con ANSYS FLUENT, sentando las bases para continuar con el diseño microfluidico para la separación L-S y finalmente, su aplicación a la captura de LPS.