Development of

Abstract

ABSTRACT: This thesis compromises two chapters. The first chapter describes a number of efforts to express and purify the acyltransferase of module 4 (fkAT4) involved in the biosynthesis of the medically important compound tacrolimus. Such efforts were attempted using E. coli and P. pastoris expression systems. Although it was possible to obtain the fkAT4 domain refolding inclusion bodies formed by E. coli, the recombinant domain purified didn’t keep the correct folding pattern, and thus in-vitro assays couldn’t be accomplished. The second chapter describes the development of Streptomyces rimosus platform as an alternative expression system for production of extracellular heterologous proteins. Results demonstrated the capacity of Streptomyces rimosus to produce phytase extracellularly, thus facilitating downstream processing. In addition, throughout a comparative analysis of S. rimosus transcriptome, the genetic information related for protein production, such as the secretion pathways (Sec and Tat) and production of endogenous proteases which can degrade the target protein, are described. Information gathered form the transcriptome enhanced the understanding of S. rimosus genetics, this way facilitating further efforts to develop the chassis of S. rimosus specific for production of heterologous proteins.

RESUMEN: La presente tesis contiene dos capítulos, el primero describe diferentes estrategias empleadas para purificar el dominio aciltransferasa del 4to modulo (fkAT4) implicado en la biosíntesis de tacrolimus, fármaco empleado como agente inmunosupresor. Para la obtención del dominio fkAT4 se usaron los sistemas de expresión basados en E. coli y P. pastoris, no obstante solo fue posible la obtención de cuerpos de inclusión, los cuales no demostraron actividad enzimática luego de ser replegados. El segundo capítulo describe el desarrollo del kit genético en Streptomyces rimosus específico para la producción de proteínas heterólogas. El kit incluye una serie de plásmidos y promotores que permitieron usar a S. rimosus como huésped en la producción extracelular de fitasa, de este modo facilitando la purificación de la encima recombinante. Además, mediante el transcriptoma de S. rimosus se pudieron establecer los diferentes mecanismos por los cuales S. rimosus secreta las proteínas al medio extracelular. El sistema desarrollado en esta tesis basado en S. rimosus ofrece una alternativa a los sistemas de expresión actuales.